Replicación de la información genética

Los estudios iniciales están hechos en células procariotas, sobre todo en Escheriricha coli. En la replicación intervienen veinte enzimas, aproximadamente, que forman un gran complejo denominado replisoma o sistema de replicasa. Y que iría replicando simultáneamente las dos hebras. Los enzimas fundamentales son las ADN polimerasas. Van a tener un orden de actuación.

Existe un punto específico del ADN en el que la replicación va a empezar:

Punto de Iniciación en Procariotas

 En Escherichica coli el punto de iniciación se denomina ori-c y tiene aproximadamente 245 pares de bases.

En Escheririchia coli la proteína de iniciación es la proteína dra A. La replicasa comienza a replicar en direcciones contrarios, con lo que se acabarán encontrando en un punto final.

Excepcionalmente, en algunos virus, a partir de un punto de iniciación habrá una sola horquilla de iniciación, siendo unidireccional en lugar de bidireccional.

El ADN eucariótico tiene varios puntos de iniciación de la réplica:

Puntos de inicio en eucariotas.

Estos puntos de iniciación promedian unas 50μm, pero este no es un valor exacto. La réplica es simultanea en las dos hebras y en las dos direcciones.

Replicación en varios puntos de inicio.

Esta imagen puede verse a microscopio electrónico, apreciándose las horquillas u ojales de ADN.

A cada unidad de replicación se les llama replicones. La unidad de síntesis es mucho más lenta que en las bacterias. Además, los cromosomas son más largos. Tener varias unidades de replicación es imprescindible, de lo contrario debería pasarse meses replicando. Comenzando en varios puntos se acelera mucho el proceso.

Las polimerasas, para actuar, deben tener separadas las hebras. De esto se encarga un enzima denominado helicasa, que consume aproximadamente 2 ATP por cada par de bases que separa.

Separación de las hebras de ADN

En la helicasa hay más de una proteína, se sabe que al menos son dos, una sobre cada hebra.

Si dejásemos así el ADN, este tendería a volver a enlazarse espontáneamente. Para evitar que se cierre el dúplex actúan otras proteínas denominadas proteínas enlazantes del ADN (DBP ó DSS). En realidad son cuatro subunidades. Una vez que una DBP se une, facilita que las demás también se unan, es decir, hay una unión cooperativa.

Pero aún se plantean más problemas. Al ir desenrollando el ADN, se irán formando superenrollamientos positivos más adelante. Al principio esto no plantea problemas serios, ya que en los cromosomas suele existir un superenrollamiento negativo, de forma que absorbe la tensión. Pero llegará un momento en el que ya no pueda con ello y empezarán a formarse demasiados superenrollamientos positivos. Pasa tanto en eucariotas como en procariotas.

Super-enrollamientos derivados de la separación de hebras.

En eucariotas el problema podría solventarse haciendo girar el resto del cromosoma. Pero esto crearía muchos problemas energéticos.

El problema es solucionado por las topoisomerasas, que actúan delante de cada horquilla evitando que se enrolle. Hay dos mecanismos distintos. Las de tipo I cortan una hebra, con lo cual la tensión se alivia al girar el otro trozo, enlazándose de nuevo donde cortamos (en lugar de girar todo el cromosoma, cortamos y hacemos girar un trozo de cromátida). El otro son las de tipo II, que actúan en Escherichia coli y que se denominan girasas. Estas van gastando energía por delante de l ahorquilla y creando superenrollamientos negativos. Tienen que romper las dos cadenas y pasar una cadena por encima de la otra para crear este superenrollamiento.

Y ahora intervendrían las ADN-polimerasas ADN-dependientes. En Escherichia coli se conocen 3, nombradas como I, II y III por orden de descubrimiento. Su actividad enzimática es actividad polimerásica, de forma que:

El enzima tiene el mismo centro activo para las cuatro bases que tiene que reconocer (es decir, dATP, dGTP, dTTP, dCTP), pero no reconocería a las dNMPs y dNDPs. Deben estar las cuatro a al vez, ya que deben ir entrando en un orden determinado y si falta una se interrumpe el proceso. Se necesita Mg2+ porque los núcleotidos (dATP, dGTP, dTTP, dCTP) se unen en un complejo que debe ser reconocido.

Todas las ADN polimerasas catalizan la síntesis de ADN en la dirección 5’→3’.

Reacción de la ADN polimerasa

Posteriormente tiene lugar la reacción:

Hacen falta otras dos cosas. Por un lado habrá un patrón que vaya indicando qué núcleotidos se deben colocar. El patrón será la otra hebra de ADN, que será leída en dirección 3’→5’.

Por otro lado, la ADN polimerasa necesita un cebador o hebra cebadora. Es decir, no puede empezar de cero, debe tener un cebador antiparalelo, perfectamente emparejado.

El cebador puede ser de ADN o de ARN. En la replicación en vivo la síntesis comienza con unas hebras cebadoras de ARN. Una vez se ha empezado, el propio ADN tiene el extremo 3’ por el que se puede guiar.

Hebras cebadoras

Hay otras dos actividades, las exonucleásicas, que consisten en hidrolizar núcleotidos a partir de uno de los extremos de uno de los polinucleótidos.

Esta reacción es válida empezando por el extremo 3’ o por el 5’. Da lugar a dos tipos, la exonucleasa 5’→3’ y la exonucleasa 3’→5’.

La actividad exonucleásica 3’→5’ es correctora, va revisando lo que acaba de polimerizar, corrigiéndola si hay errores. Si encuentra un error, se hidroliza el nucleótido y lo repite. Como vemos, va en sentido contrario de la síntesis.

Actividad correctora: exonucleasa 3' 5'

El factor de error de la polimerasa es de entre 10-4 y 10-5 sin la actividad correctora. Gracias a la actividad correctora este error disminuye al menos a 10-7 e incluso menos (10-9 ó 10-10).

La exonucleasa 5’→3’ tiene su punto de acción por delante de la polimerasa. Va limpiando el camino, hidroliza bases que sobrasen.

La ADN-polimerasa I es la más abundante en Escherichia coli. Existen alrededor de 400 copias por célula. Su velocidad es de unos 600 nucleótidos por minuto.

La ADN-polimerasa III es un complejo grande, de al menos trece subunidades y con muchas funciones. Son menos abundantes, alrededor de 20 por célula, pero actúan muy rápido, unos 10000 nucleótidos por minuto. En vivo podría actuar incluso más deprisa. Posee una replicasa denominada haloenzima-polimersa III.

De la ADN-polimerasa II no se conoce bien su función. Es mucho más lenta, entre 20 y 30 nucleótidos por minuto y no tiene actividad exonucleásica 5’→3’. Pero si tiene actividad correctora, es decir, actividad exonucleásica 3’→5’.

Las células eucarióticas tienen ADN polimerasas que actúan igual, tanto en sentido, como en la necesidad de patrón y de cebador. Las funciones exonucleásicas pueden aparecer o no dependiendo de la polimerasa.

Hay tres tipos, α, β y γ. La α viene a ser, aproximadamente, la polimerasa III de Escherichia coli. Es la que replica la mayor parte del ADN. La β colabora y repara. La γ aparece en las mitocondrias y se encarga de duplicar el ADN mitocondrial.

La réplica de una hebra y otra es simultanea, pero no va a ser igual. Una va a ser continua y la otra discontinua, ya que las dos hebras molde son antiparalelas y si en una de ellas el avance va en sentido 5’→3’, en la otra irá en dirección 3’→5’. Pero las polimerasas conocidas solo incorporan nucleótidos en la dirección 5’→3’. El hecho de que la réplica en la otra dirección no tiene lugar fue comprobado por Okazaki. La réplica tendrá lugar en la misma dirección en las dos hebras, lo que ocurre es que se van haciendo tramos en la dirección 5’→3’.

Habrá por lo tanto una hebra retardada o seguidora, en la que la síntesis será discontinua, fragmentada. La incorporación se va haciendo en pequeños fragmentos en dirección 5’→3’ que después, sucesivamente, se unen. Se les denomina fragmentos de Okazaki. A la hebra que avanza de forma continua se le denomina hebra guía o conductora en síntesis continua.

Si lo vemos a partir de un punto de iniciación, hacia un lado veremos una hebra continua y otra discontinua:

Las ADN polimerasas, tanto para fabricar la hebra continua como los fragmentos de ozkazaki, requieren cebadores para empezar. El cebador va a ser de ARN, aunque después va a ser sustituido. Se trata de un proceso progresivo, se van poniendo y quitando cebadores.

El ARN cebador es fabricado por la primasas, una ARN-polimerasa ADN dependiente. Sintetiza ARN a partir de ADN, como siempre en dirección 5’→3’.

(NTP)n + NTP → (NTP)n+1 + PPi

La primasa no necesita cebador y carece de capacidad correctora, no tiene actividad exonucleásica 3’→5’. El nivel de errores será mucho mayor, pero carece de importancia porque después los cebadores se quitan.

La primasa forma parte del primosoma, un complejo en el cual hay al menos seis proteínas adicionales más. El primosoma forma, a su vez, parte del replisoma antes citado. Las otras proteínas del primosoma tienen distintas funciones, como hidrolizar ATP para conseguir energía (sin este consumo de ATP, la síntesis no funciona).

Primer actúa la primasa, fabricando el cebador en el punto de iniciación. La ADN-plimerasa III utiliza como inicio el hidroxilo 3’ del ARN cebador. Y comenzará a sintetizar, terminando cuando se encuentre con algo que la pare, como el inicio de otro replicón (1).

Posteriormente la primasa fabricará otro cebador, situándolo a una distancia igual al número de nucleótidos que posea el fragmento de Okazaki, es decir, lo sitúa a una distancia igual al tamaño de un fragmento (2).

La ADN-polimersa III sintetiza el primer fragmento de Okazaki a partir de este cebador, rellenando el hueco que queda entre los dos cebadores. Se detiene cuando encuentra el cebador de inicio, es decir, el primer cebador. Cuando la ADN-polimersa III encuentra el obstáculo se encuentra por delante, por lo cual su actividad exonucleásica no puede actuar, no puede eliminar el ARN cebador con el que se encuentra. Y quedará, además, un nucleótido por poner. En el extremo 5’ del cebador hay un grupo trifosfato sobre el que no puede actuar la ligasa, quedando una brecha (3).

Ahora actuará la ADN-polimersa I. Con su actividad exonucleásica 5’→3’ hidrolizará los nucleótidos del ARN cebador. Y actuará también como polimerasa 5’→3’. La ADN-polimerasa I usará como cebador el extremo 3’ terminal que ha dejado la ADN-polimersa III al fabricar el fragmento de Okazaki. Es decir, usará como cebador ADN en lugar de ARN. Y rellena el fragmento, qudando en la zona trozos de ARN del cebador destrozados por la ADN-polimersa I (4).

Ahora ya puede actuar la ADN-ligasa. Une el fosfato 3’ terminal de un extremo fosfato con el 5’ del otro lado. Ahora ya puede actuar, porque al actuar la ADN-polimersa I ya no hay grupo trifosfato (5).

Como vemos, el tamaño de un fragmento de Okazaki es lo que hidroliza la ADN-polimerasa III y lo que sintetiza la ADN-polimerasa I. Todos los cebadores son iguales..

A partir de esto, se repite y a una distancia igual al tamaño de un fragmento de Okazaki vuelve a colocarse otro cebador.

El esquema es el siguiente:

Podemos ver un pequeño esquema de lo que ocurre con un ADN circular de una bacteria:

El último cebador actúa como molde para la ADN polimerasa I, hidrolizando posteriormente este cebador y actuando la ligasa. Esto ocurrirá en las dos copias.

En eucariotas ocurriría algo parecido, pero con los replicones que se van encontrando:

Replicasa y replisoma deben tener una orientación espacial concreta. En el replisoma primero irá la helicasa y los enzimas auxiliares (BDP). Después irá la primasa, encargada de hacer el primer cebador. Solo se necesita una, ya que primero hace el cebador de una y después se dedica a sintetizar todos los cebadores posteriores. Y detrás, las dos ADN polimerasas III, una a cada lado. No son exactamente iguales, ya que una se encarga de sintetizar la hebra adelantada y la otra a la seguidora. Aunque no son exactamente iguales, son parecidas. La hebra molde debe hacer un bucle sobre la ADN polimersa III para conseguir que el cebador se fabrique en la dirección correcta. La molde hace ese rizo o bucle, posteriormente se deshace cuando se ha sintetizado el fragmento, avanza un poco y se vuelve a enrollar.

La ADN polimerasa III de la seguidora va un poco más atrás debido al bucle que se va formando, que hace el doblez. De hecho, comenzó un poco antes.

Pero ¿qué ocurre con las proteínas histónicas en los eucariotas? Tienen que sintetizar nuevas histonas, deben formarse otras tantas como las que había, las antiguas no se degradan, se aprovechan. Por métodos radiactivos se ha demostrado que los octámeros antiguos y los nuevos van separados, no se intercambian las nuevas con las antiguas. Las histonas nuevas van solo al ADN replicado y solo a uno de los dos dúplex hijos, uno se lleva los octámeros viejos y el otro todos los antiguos (a partir del punto de inicio).

Parece que cuando el ADN se está replicando, los octámeros paternos antiguos son aprovechados por la hebra continua. Las nuevas son asociados al dúplex de la hebra retardada.