Microscopía: fundamentos de óptica

Comenzaremos con la microscopía óptica o fotónica. Cualquier medio que deje pasar la luz se caracteriza por una constante, llamada n, que corresponde a índice de refracción, que refleja la velocidad de la luz en ese medio:

Microscopio de Hook

Donde c es la velocidad de la luz en el vacío y v la velocidad de la luz en el medio.

Si consideramos dos medios refringentes separados por una determinada frontera, diremos que tenemos un dióptrio. Por ejemplo, lo siguiente representa un dióptrio plano:

Dióptrico

También podemos encontrar otras situaciones, como un dipotrio esférico:

Dióptrico esférico

Una lente son dos dióptrios en sucesión. En el caso simple de una lente, con sección por la mitad, obtendríamos la sucesión de dos dióptrios esféricos:

Lente convergente

Construyamos como construyamos la lente, para que funcione, es indispensable que uno de los dos dióptrios sea esférico. En caso contrario, obtendríamos una lámina de caras paralelas. Estas también modificarían la actividad óptica. De hecho, los cubreobjetos, que poseen caras paralelas, deben tener un grosor fijo de 0,17mm.

Con dos dioptrios curvos podemos también obtener una lente con el siguiente perfil:

Lente divergente

Con estos dos dioptrios obtenemos lo que se denomina lente convergente, en l cual los rayos que entran tienden a converger en un puno y lo que se denomina lentes divergentes, que por si solas no pueden formar una imagen, necesitan de otra lente asociada y que son las lentes más usadas para corregir la miopía.

Lentes convergente y divergente

La lente, por perfecta que sea, nunca formará una imagen perfecta de lo que estamos observando. Siempre hay un error, una deformación. Se les denomina aberraciones y hay varios tipos. Una aberración bastante molesta es la aberración cromática, en la cual la luz, al estar compuesta por varias longitudes de onda y converger en la lente convergente, algunas longitudes de onda tiende a converger, sobre todo el azul que tiende a converger en el mismo punto que el rojo, obteniendo muchas imágenes de distintos colores.

Todos estos problemas de las aberraciones han ido siendo solucionados en la microscopía óptica. No sucede lo mismo en la microscopía electrónica.

Las lentes divergentes presentan aberración cromática inversa a la convergente. Si asociamos ambas lentes, solucionaremos el problema. Para ello se usan dobletes acromáticos, un sistema sencillo que combina una lente convergente y una divergente:

Doblete acromático

Más efectivo es el tripleta acromático:

Tripleta acromático

Tanto las lentes como el material que se usa para prepararlas, así como el material de la propia lente y el perfil de curvatura deben ser buenos. Cualquier asociación de lentes se puede reducir a una sola lente equivalente, que funcionaría por si sola como funciona todo el sistema.

Diferenciar una lente convergente de una divergente es sencilla solo con el tacto, ya que las divergentes son más finas por el centro que por los extremos y las convergentes son más gruesas por el centro.

Trabajaremos con lentes ideales y cuyo grosor se puede considerar despreciable frente a su radio de curvatura (es decir, su superficie). Todos los elementos ópticos de un aparato estarán centrados sobre el eje óptico de la lente.

Lente convergente ideal

Si hacemos llegar un haz de rayos paralelos a la lente, estos rayos lo atraviesan y concentran la energía en un punto. Este punto en el que se concentra la luz es el foco de la lente. Una lente tiene dos puntos focales. En el caso más simple, están colocados a la misma distancia del centro. Pero esto solo es cierto cuando los dos medios que rodean la lente son iguales. Las distancias entre el foco y el eje de la lente se denomina distancia focal. Si consideramos dos planos perpendiculares al eje óptico que pasa por los focos, hablaremos de planos focales.

La lente divide el espacio en dos mitades, el lado objeto, que es donde colocamos el objeto, y el objeto imagen.

Un haz de rayos paralelos converge en el foco solo cuando los rayos son paralelos al eje óptico. Todos los rayos paralelos, independientemente de su ángulo, convergen en un solo punto. No tiene porque ser el foco, pero se encuentra siempre en el plano focal:

Plan focal

Para saber donde convergen los rayos trazaremos rayos auxiliares, paralelos a los ejes problema, que pasan por el otro foco de la lente. Sabemos que el rayo que pase por el foco, será paralelo al eje óptico, ya que cualquier rayo que pase por el eje óptico, sea cual sea su ángulo, saldrá de la lente paralelo al eje óptico.

Analizaremos ahora el funcionamiento de las lentes en un microscopio. Para ello, usaremos los siguientes símbolos:

Símbolos ópticos

Veamos como funciona una lente convergen en función de la distancia entre el objeto y la lente, colocada esta más allá del foco.

Funcionamiento de lentes

Como vemos la imagen resultante en 1 es invertido respecto al objeto y de menor tamaño. Cuando nos acercamos al foco, como ocurre en el esquema 2, vemos que la imagen sigue siendo invertida, pero su tamaño es de mayor tamaño que el objeto y se va alejando cada vez más de la lente. Según nos vamos acercando, llega un punto en el que la imagen es del mismo tamaño que el objeto. Ese punto sería cuando la distancia del objeta será el doble que la distancia a la lente. La imagen estaría también al doble de la distancia del foco. De ahí en adelante, como ocurre en el esquema 2, el tamaño de la imagen resultante es de mayor tamaño que el objeto. De esta forma funcionan los objetivos de los microscopios o la lente de un proyector de diapositivas.

Pero de todos estos rayos, algunos se cruzaran. Los podemos proyectar sobre un papel. Se les llama imágenes reales.

Si ponemos el objeto sobre el foco, los rayos que saldrán de la lente serán paralelos:

Lentes: objeto en el foco

Como son paralelos, nunca se cortan. Y si acercamos el objeto más a la lente, por delante del foco, los rayos que salen no confluirán, sino que divergirán. A partir del punto focal, los rayos serán divergentes. No habrá formación de imagen real y se formarán lo que denominamos imágenes virtuales. Precisamente en este espacio es como trabajan las lupas o los oculares de los microscopios. Y es que, si detrás de la primera lente principal, colocamos una segunda lente, podemos hacer converger los rayos paralelos. Y en nuestro ojo se encuentra precisamente esa lente: el cristalino:

Cuando el objeto está más cerca del foco, está demostrado que el objeto que vemos es el mismo que si lanzamos hacia atrás las líneas y vemos donde convergen. Además, en este caso, no hay inversión de la imagen.

Objeto más cerca de la lente que el foco

Así funciona el microscopio óptico. Son dos grupos de lentes. El objetivo forma una imagen invertida y de mayor tamaño. Eso es lo que vemos cuando utilizamos el ocular en forma de lupa.

En el caso del ojo humano, el cristalino es una lente biconvexa elástica. La curvatura de las caras puede variar. Si variamos el radio de las caras, variamos la lente. A pesar de que la retina se encuentra siempre a la misma distancia, gracias a eso, podemos enforcar un objeto desde una distancia infinita, con el ojo en reposo, hasta una distancia mínima de unos 25 centímetros. La cifra de 25cm es una medio, pero es imprescindible para los cálculos a la hora de fabricar objetos ópticos como lupas y microscopios.

El aumento de una lupa viene establecida por la fórmula:

Donde l es la distancia mínima de enfoque y F la distancia focal de la lente. Válida para el ojo enfocado hacia el infinito. Si el ojo no está enfocado al infinito, es decir, relajado, hay que sumar una unidad. Y si una persona posee un defecto y el valor de l es menor de 25, la lente disminuye se capacidad de aumento.

Esquema del funcionamiento de lentes con adicción del cristalino (en rojo)

Para evitar fatiga ocular, el ojo debe estar enfocado en el infinito. Para eso, los rayos deben venir paralelos al ojo. Entonces el ocular deben tener el foco en la imagen intermedia. Ocular y objetivo van montados en un tubo, de tal manera que no se puede mover la distancia entre las lentes. Hay que mover la distancia entre la lente y el objetivo para que el sistema funcione. Entre F1’ y F2 hay un espacio que se llama Δ y que es el espacio óptico. Si utilizamos un objetivo con F1 y un ocular con F2 se puede demostrar que el aumento total obtenido viene dado por la siguiente fórmula:

En esta ecuación, el aumento del ocular vendrá dado por la fórmula:

Por trigonometría sabemos que:

 Y dado que Y’ corresponde al tamaño del objeto que da el objetivo y que Y es el tamaño real del objeto, podemos concluir que esa fracción corresponde al aumento del objetivo. En resumen, el aumento total corresponde al producto del aumento del ocular por el aumento del objetivo:

Los aumentos proporcionales por un objeto óptico no dicen nada, la difracción condiciona el límite o poder de resolución. Se refiere a la mínima distancia entre dos puntos del objeto que es capaz de ver el microscopio como objetos separados.

Debido a la naturaleza ondulatoria de la luz, cuando un rayo luminoso atraviesa los bordes de un objeto, el rayo fundamental sigue su trayectoria, pero aparecen rayos en todas las direcciones, originados por difracción.

Difracción

Los rayos secundarios aparecen adelantados o atrasados y son capaces de producir fenómenos de interferencia, bien de refuerzo o de atenuación. En el refuerzo, los rayos se encuentran en fase. En la atenuación, los rayos se encuentran en oposición de fase.

Fases: refuerzo y atenuación

Si en lugar de un borde tenemos un orifico, la situación es la misma. Si hacemos pasar un haz de luz por u orificio, encontraremos máximos y mínimos seguidos, que se manifestarán como círculos claros y oscuros consecutivos. Y hablaremos de un valor de máxima luminosidad en el máximo central (orden 0) y mínimos consecutivos (que se denominan primer mínimo, segundo mínimo, etc.). para cada elemento de imagen, el que más participa es el más luminoso. Los demás poseen muy poca luz.

Curva de máxima luminosidad

Un rango de luz procedente de un punto, al atravesar el sistema de una lente, se rompe en varios rayos. Y nos forman el espectro de difracción. A causa de los fenómenos de interferencia, cualquier objeto óptico es incapaz de hacer que a un punto del objeto le corresponda un punto, sino un disco de interferencia. Estos discos de interferencia será la unidad en que estará compuesta la imagen. Se habla de discos de difracción o discos de Azry.

Discos de Arzy

Si nuestra imagen está formada por elementos discoidales, todas las estructuras más pequeñas que el disco de difracción no se podrán ver.

Efecto de los discos de Arzy

En estas condiciones el objeto de óptica nos está resolviendo los puntos A y B. Cuando disminuimos las distancias entre A y B (por ejemplo, el punto B’), se forman discos de difracción tangentes que se van acercando, hasta que los puntos se acerquen tanto que los discos, a nivel de imagen, acabarán por superponerse. Y al final llegará un momento en que, a nivel de imagen, los discos de difracción confluirán. Hemos alcanzado el límite de resolución del aparato. El límite de resolución se alcanza, pues, cuando dos discos de resolución llegan a estar a una distancia tal que el centro de una se encuentra en el borde de la otra, pues si se mueve un poco más, ya no se podrán distinguir.

Sobreposición de discos de Arzy

El límite de resolución de un aparato de óptica se alcanza cuando la distancia entre los dos máximos focales es igual al radio del primer mínimo.

Si nuestra imagen está formada por un mosaico de discos de Azry, al aumentar mucho, acabaremos viendo los discos de mayor tamaño, pero no veremos nuevas estructuras. No vemos detalles nuevos. Este es el aumento útil y se sobrepasa antes de lo que parece. En el microscopio óptico este límite se supera a partir de unos 500 aumentos. Entramos en lo que se llama aumento vacío. Se usan más aumentos para que las estructuras pequeñas se vean mejor y el ojo no se fatigue. El poder de resolución de un microscopio vendrá dado por la siguiente ecuación:

 

Donde d es el poder de resolución, que debe ser lo más pequeño posible (cuanto más pequeño sea el poder de resolución, más aumentos se pueden conseguir), NA es el número de apertura y λ es la longitud de onda. Esta longitud de onda, esta se encuentra entre los 4000 y los 8000 amgstrongs (luz visible).

El significado del número de apertura, NA, está relacionado con el ángulo de apertura, denominado α. Cuanto más amplio sea, más resolución tiene el objetivo, porque más pequeños son los discos de refracción que se producen.

Número de Apertura: ángulo alfa

Entre la muestra y el objetivo hay un medio. El valor final del número de apertura, NA, vendrá dado por la fórmula:

El valor de NA tiene un problema. A mayor diámetro de la lente, mayor cantidad de defectos posee la misma. El máximo valor para objetivos de inmersión es de un NA de 1,3. Es la apertura máxima que podemos obtener. Si aplicamos lo que conocemos, en el mejor de los casos obtendríamos un valor de d de 1876,9 amstrongs, o lo que es lo mismo, alrededor de 1,8μm.

La luz ultravioleta tiene una longitud de onda más bajo, pero no es adecuada, ya que es peligrosa y no es visible. Se fabricaron microscopios para luz ultravioleta, pero no se usan para observar directamente, sino para sacar fotografías. Estos consiguen un valor de d de alrededor de 0,18μm.

Sin embargo, estos valores no son reales, ya que el ojo humano tiene también un poder de resolución, que ronda los 0,1mm, aproximadamente. Es decir, que realmente el microscopio separará dos puntos distanciados alrededor de 100μm. Para obtener el valor real máximo de aumentos, por lo tanto, la fórmula nos dirá que:

Es decir, que un microscopio óptico ideal no irá más allá de estos alrededor de 550 aumentos. Los objetivos de inmersión permiten un mayor poder de resolución. Ya que el valor de n del aire es 1, pero el valor de n del aceite es de 15,15, por lo que el valor de NA en este caso es de 15,15.

Habitualmente, toda esta información vendrá grabada en el objetivo del microscopio, en el que encontraremos los siguientes números grabados.

Ejemplo de números en el objetivo

Donde, en este ejemplo, 40 son los aumentos, 0,65 la apertura, 160 la longitud del tubo y 0,17 el grosor que debe tener el cubreobjetos.

En cuanto al ocular, este suele estar constituido por dos lentes. La lente superior debe tener, al menos, el diámetro de la pupila del ojo. La lente inferior concentrará la luz sobre la lente superior, actuando como una especie de colector.

Ocular

Imaginemos una superficie del objeto, por ejemplo un cuadrado de 1μm de arista. Este dejará pasar una cierta cantidad de luz. Si lo miramos con 100 aumentos, el cuadrado de 1μm será vista con una tamaño de 100μm de arista. Pero la variación de área es mucho mayor, ya que pasa de 1μm2 a 10000μm2. La intensidad de la iluminación baja y debemos iluminar fuertemente el objeto. De esto se encarga el condensador.

Condensador

El condensador siempre tiene que estar cerca de la muestra, de forma que el haz de luz no llegue en males condiciones. De lo contrario, no llegará con toda su amplitud. El diafragma controlará el paso de luz. Si se encuentra más cerrado de la cuenta, se darán problemas de refracción, ya que los rayos que salen del condensador se reflectarán y podremos encontrarnos con que vemos imágenes superpuestas.

Como ya indicamos, algunos microscopios no usan luz normal visible, sino otras longitudes de onda. Se han construido microscopios con luz infrarroja, que tienen muy mala resolución, ya que la longitud de onda de los rayos infrarrojos es mayor que la de la luz visible. Pero se usan para ver muestras que con la luz visible son muy opacos, como muestras ricas en melanina. También se han fabricado microscopias de luz ultravioleta, que convertimos en luz visible gracias a una placa fluorescente. Se usan fluorocromos, es decir, sustancias que se excitan con mucha facilidad, se eleva el nivel de energía de sus electrones, que saltan a niveles energéticos superiores y al perder esa energía y volver a su estado energético inicial devuelven la energía en forma de luz, pero en este caso de luz visible en lugar de ultravioleta (es decir, con una longitud de onda inferior).

Otros microscopios son los interferenciales. Por ejemplo, el de contraste de fases y el interferencial de Nomarsky. Habitualmente, los cortes de tejidos usados deben ser muy delgados para que pase la luz. Los tejidos no suelen tener color propio. En una lámina transparente no podríamos distinguir elementos ni estructuras. Debemos añadir contraste a la muestra, para conseguir un contraste en las longitudes de onda, es decir, teñir la muestra. Pero al teñir la muestra debemos matar a las células. Aunque existen algunos colorantes vitales, que no matan a las células, estos son escasos y su uso es muy limitado. Otro sistema para ver células vivas se usan estos microscopios de contraste. Los distintas partículas del objeto, al chocar contra ellas la luz, producirán un fenómeno de difracción. En un microscopio normal, el rayo directo será demasiado grande para que los rayos refractados ocasionen molestias. El rayo difractado tendrá un retraso de, aproximadamente, un cuarto de longitud de onda (es decir, 1/4λ). El microscopio de contraste añade, ópticamente, otro cuarto de longitud de onda de retraso al rayo principal, de este modo, los rayos normales y los difractados tendrán un retraso de un medio de longitud de onda (1/2λ). Es el máximo desfase posible. Para conseguir este desfase se hace pasar por una lámina transparente.

Interferencial

En el condensador, en lugar de un diafragma en forma de iris, hay un diafragma anular del que sale la luz en forma de anillo.

Condensador en anillo de un microscopio interferencial

Para cada objetivo, debe tener una lámina de fase incorporada y debe usarse su diafragma anular apropiado.

El microscopio interferencial de Nomarsky es parecido, pero se usa luz polarizada y tiene ciertas características propias.

Otro tipo de microscopios son los de campo oscuro. Surgieron en el intento de vencer la barrera de la resolución. Usan una iluminación muy oblicua. Las partículas muy pequeñas, que no se verían en un microscopia normal, aparecerán como rayos refractados.

Microscopio de campo oscuro

Veremos un fondo oscuro y las moléculas pequeñas aparecerán como puntos luminosos. La iluminación oblicua puede obtenerse por varios mecanismos. Se usan condensadores especiales, que hacen que la luz se proyecte de forma transversal.

Condensador de microscopio de campo oscuro

El microscopio de polarización es un microscopio normal, pero con un polarizador entre la fuente de luz y el objeto, con un analizador en el objetivo. Las partes de la muestra que tengan actividad óptica quedarán iluminadas, como por ejemplo los granos de almidón o algunas inclusiones de tipo cristalino.

La solución más habitual para conseguir más aumentos es el uso del microscopio electrónico. La calidad de las observaciones responde a las mismas ecuaciones que el microscopio óptico y lo más importante es el límite de resolución.

Los electrones deben moverse por el vacío, por lo que el valor de n será siempre 1. La apertura de las lentes electromagnéticas, es decir, su valor de α, es muy pequeño. Esto hace que, matemáticamente, el valor de sen α pueda ser sustituido por el valor de α directamente, ya que el error que cometemos es muy pequeño. De esta forma, la fórmula puede expresarse de la siguiente manera:

Para hacer más pequeño el valor de d, hay que variar el valor de λ. Y este valor podemos manipularlo prácticamente a nuestro antojo. Sabemos que la energía de una radiación electromagnética puede expresarse de dos maneras:

Donde m es la masa del electrón y c su velocidad (extensión de De Broglie a la ecuación de la luz). Igualando ambos valores podemos deducir que:

De donde llegamos a la conclusión de que:

Existen dos maneras de expresar la energía cinética:

Donde V es el valor del potencial y e- la carga del electrón. Sustituyendo el valor de la velocidad que obtuvimos con anterioridad, igualando las dos ecuaciones y operando se llega a la siguiente expresión:

De lo que se deduce que podemos variar el valor de la longitud de onda variando el potencial. Los microscopios electrónicos llegan a potenciales de alrededor de 100 Kv de potencia, con lo que su longitud de onda sería de alrededor de 0,039 amstrongs. Debemos tener en cuenta que el microscopio óptico os resolvía a 4000 amstrongs, por lo que podemos ver que la diferencia en el número de aumentos que se puede conseguir es enorme.

Claro que este valor es teórico, ya que la comparación se está llevando a cabo con las longitudes de onda, pero con el microscopio electrónico usaremos otros números de apertura. Y es que el microscopio electrónico presenta un problema importante de aberración esférica que no se puede corregir. La aberración esférica surge cuando la lente no es perfecta y la zona central y la periférica no poseen el mismo foco, con lo que la imagen se repartirá entre los dos focos más alejados.

Para solucionar este problema debemos eliminar los rayos más periféricos, dejando pasar solo los rayos más paraxiales, es decir, los próximos al eje. Pero esto hace que el ángulo α se vea reducido. En el microscopio electrónico, con este fin, el ángulo α ronda los 4.10-3 rad.

Control de la aberración esférica

Para medir la aberración esférica se usa esta fórmula:

Donde K es una constate, f la distancia focal y α el ángulo. Debemos tener en cuenta que el ángulo está elevado al cubo y que tiene un efecto contrario al que tiene en la fórmula de la resolución, ya que en este caso se encuentra multiplicando en lugar de dividiendo. Como ya indicamos, el valor del ángulo óptimo es de 4.10-3 rad, por lo que:

Y con esto obtendremos valores de resolución teóricos de unos 2 amstrongs y prácticos de entre 4 y 6 amstrongs. Para estudios morfológicos estos valores son claramente excesivos, no necesitamos un aumento tan elevado.

Para calcular el aumento útil y teniendo en cuenta que el ojo humano resuelve en 0,1mm, tendremos la siguiente fórmula:

Es decir, quinientos mil aumentos. Para materiales biológicos es un valor excesivo, trabajándose normalmente entre valores de 20000 y 100000 aumentos. A partir de ahí penetramos en estructuras puramente moleculares, perdiendo información morfológica.

Otro valor que debemos tener en cuenta es la profundidad de campo. Para comprenderlo, analicemos el esquema.

Profundidad de campo

Mientras el tamaño de los discos sean más pequeños o iguales que el disco P0 no aparecerán problemas. Esto es lo que se denomina profundidad de foco, se representa por el valor D y viene dado por la fórmula.

Para el microscopio óptico, este valor D ronda las 5μm. En el microscopio electrónico será mucho mayor. Los problemas de enfoque serán mayores. Pero el grosor de los cortes no sobrepasará el valor de 700-800 amstrongs.

La estructura del microscopio electrónico es similar a la de un microscopio óptico invertido, ya que la fuente de electrones se sitúa arriba, por debajo encontramos el condensador, el objetivo, que constará de dos grandes lentes, la intermedia superior y la difractara inferior. Por debajo de los objetivos encontramos la lente proyectora, que proyecta la imagen sobre la pantalla fluorescente, que es la parte inferior del microscopio electrónico.

Comenzando por la fuente, esta debe ser un emisor de electrones. El conjunto se denomina cañón de electrones y su parte emisora está formada por un filamento de tungsteno (o en general de materiales con poca afinidad electrónica).

Los antiguos cañones de electrones tenía una estructura similar a la que se muestra en este esquema.

Esquema de un antiguo cañón de electrones

En el microscopio observamos el emisor de electores, el ánodo y la lente electromagnética.

En las lentes electromagnéticas, la distancia focal es función de la intensidad del campo electromagnético y de la intensidad de la corriente que pasa por el arrollamiento. Esto se resume con la siguiente fórmula:

Donde DF es la distancia foca, β el número de vueltas del arrollamiento y NI la intensidad de corriente. Al aumentar el voltaje aumentamos la intensidad y de esta manera hacemos variar la distancia focal de la lente. Generalmente hay dos condensadores.

El tipo de cañón del esquema tiene un rendimiento bajo. Otros sistema más moderno consiste en colocar en los bordes del filamento una red de resistencia. La caída de potencial hace que la pared o cilindro de hacer del emisor tenga algo de carga negativo, con lo que los electrones serán repelidos por esta pared y saldrán por el orificio de salida. Se habla de cañón influido o polarizado.

Cañón influido o polarizado

El sistema de formación de imágenes es distinto al del microscopio óptico. Cuando el haz de electrones atraviesa la muestra, algunos se desvían. Estos no van a pasar a formar parte de la imagen, en el lugar donde se vean desviados no habrá electrones. Este desvío es llevado a cabo por átomos pesados. Los materiales biológicos no son ricos en átomos pesados, por eso las muestras son contrastadas con sustancias ricas en este tipo de átomos, como derivados del plomo, el uranio o el osmio.

Desvío de electrones por metales pesados

De los apuntes de microscopía de Delio Tolivia, i.m.