sábado, 30 de junio de 2012

ARN ribosomal y fabricación de ribosomas


El ARN ribosomal (ARNr) constituye, junto con varias proteínas, los ribosomas. El ribosoma es la parte esencial de traducción del ARN. Los ribosomas de procariotas y eucariotas son ligeramente diferentes. Ambos están compuestos por dos subunidades, pero los de procariotas son más pequeños, denomnándose 70s, frente a los eucariotas que se denominan 80s (estas cifras corresponden a medidas de centrifugación).
Ribosomas

En cualquier caso, no se sabe como es exactamente la forma de los ribosomas, variando además de unos organismos a otros. Sabemos, por ejemplo, que el ribosoma de Escrherichia coli la subunidad grande tiene tres huecos donde se engancha la subunidad pequeña, la subunidad pequeña es liberametne alargada, on un estrechamiento, situada a 1/3 de su longitud total, por el que se introduciría el ARN mensajero.

En el caso del ribosoma procariota, sus dos subunidades son, una grande 50s y una pequeña 30s. La subunidad 50s está compuesta por un ARNr 23s, un ARNr 5s y 31 proteínas distintas, denominadas proteínas L. La subuniad 30s está compuesta por un ARNr 16s y 21 proteínas distintas, denominadas proteínas S.

En el caso del ribosoma eucariota, posee una subunidad grande 60s y una subunidad pequeña 40s. La subunidad 60s está compuesta por un ARNr 28s, un ARNr 5,8s y un ARNr 5s, además de 49 proteínas distintas. Y la subunidad 40s está ocmpuesta por un ARNr 18s y 33 proteínas distintas.
Ribosomas Procariotas y Eucariotas
 Para que se mantengan unidos, debe tener una concentración mínima de magnesio. Si la concentración de Mg2+ baja de 1mM, se disociarán las dos subunidades.

Cada tipo de ARNr tendrá una conformación. Alternan zonas de bases apareadas con bases desapareadas. La concentración de pases apareadas supondrá, aproxiamadamente, el 70%.
ARNr
 Las proteínas de los ribosomas tienen carácter básico, siendo ricas en cargas positivas. Pero el ribosoma tiene, en su totalidad, carga eléctrica negativa, debido sobre todo a las cargas negativas de los grupos fosfato del ARN.

Una vez se han constituido las subunidades (a partir de sus elementos) se unen por reconocimiento específico. Este reconocimiento y unión tiene lugar de forma expontanea.

En el caso de células eucariotas podemos encontrar, además de los ribosomas del citoplasma, ribosomas en las mitocondrias y cloroplastos. Son más pequeños que los citoplasmáticos y se parecen bastante a los ribosomas procarióticos (constituyendo una prueba del origen procariota de las mitocondrias y cloroplastos).

Todos los ARNr son expresiones finales de genes. Expresiones que, posteriormente, no son traducidas (es decir, se transcribe el gen, pero no se traduce). Esto va a generar un problema respecto a la velocidad de síntesis. Cuando se duplica la célula, debe duplicar sus ribosomas y una célula puede tener de ocho a diez millones de ribosomas. Si solo tuviese un gen determinado de cada tipo de ARNr, sintetizar una cantidad grande de ARN para producir muchos ribosomas supondría demasiado tiempo. Normalmente, las células tienen ejemplares repetidos de los genes del ARNr (también sucede con los ARNt). En el caso de los ARNm, no se necesitan tener también genes estructurales de los ribosomas repetidos de esta forma(los genes que, una vez traducidos, dan lugar a las proteínas del ribosoma), ya que un solo ARNm puede traducirse muchas veces, incluso millones de veces. Es decir, un solo ARNm puede dar lugar a varios millones de polipéptidos. Por eso estos genes no suelen venir repetidos. En cambio, si que vendrán repetidos los genes de las histonas.

Fabricación de proteínas ribosomales y ARN ribosomal (ARNr).

El ARNr se forma a partir de precursores más grandes, que después son cortados (maduración postranscripcional). Veremos el proceso en eucariotas.

Las proteínas ribosomales se tienen que sintetizar en el citoplasma. Una vez se ha traducido el ARNm las proteínas vuelven al núcleo y es en el núcleo donde se unen al resto de componentes.

Los cuatro tipos de ARNr van a ser codificados por dos genes. Uno de ellos es el gen encargado del ARNr 5s. Se encuentra en diversos cromosomas (como ya indicamos, hay varias copias) y forma parte del nucleolo. Es transcrito por al ARN pol III.
ARNr 5s
 Otro gen va a dar lugar a un ARN 45s. Hay varias copias, separadas por espaciadores. Al complejo de los genes ARN 45s se le denomina organizador nucleolar, ya que a partir de ellos se formará el nucleolo. Estos genes son transcritos por la ARN polimerasa I. Se generan copias de un ARN 45s que contiene en su interior los ARNr 18s, 5,8s y 28s. Estos tres se separan por la acción de exonucleasas, que eliminan lo que les sobra por los extremos y endocucleasas que eliminan las partes interiores del ARN 45s que separa los tres fragmentos. Por metiliación del –OH de ciertas ribosas se marca la parte del ARN 45s que debe ser degradado por las endonucleasas y exonucleasas.
ARNr 18s, 5,8s y 28s
 El ARNr 18s, junto con las proteínas S, formarán la subunidad pequeña. El ARNr 5,8 s, junto con el ARN 28s, el ARN 5s y las proteínas L formarán la subunidad grande.

Todo esto va a un tiempo, es decir, todo el proceso tiene lugar a la vez. Las proteínas van al nucleolo, que es el lugar donde tienen lugar todos estos procesos.
Fabricación de ribosomas
 En los procariotas, hay tres tipos de ARN: el 16s, el 23s y el 5s. Los tres se forman a partir de un precursor más largo, ARNr 30s. En mitad del precursor encontraremos en algunos casos una o dos secuencias que codifica para el ARNt.
ARNr en procariotas
 El proceso es, en esencia, igual al de eucariotas. Se produce la maduración y a la vez se le añaden las proteínas.

En ciertos caos hay que eliminar intones (scplicing o corte y empalme). En vez de eliminar intrones propiamente dichos, se eliminan los trozos del medio de ARN que tendrían que estar juntos. Se sabe que los ARNr de algunos procariotas y eucariotas unicelulares eliminan intrones por un proceso de autosplicing o autoemplame, en el cual no intervienen enzimas que catalicen el proceso. Este descubrimeinto fue una prueba que demostraba qu ciertos ARN poseían actividad autoenzimática.

lunes, 11 de junio de 2012

Replicación de la información genética


Los estudios iniciales están hechos en células procariotas, sobre todo en Escheriricha coli. En la replicación intervienen veinte enzimas, aproximadamente, que forman un gran complejo denominado replisoma o sistema de replicasa. Y que iría replicando simultáneamente las dos hebras. Los enzimas fundamentales son las ADN polimerasas. Van a tener un orden de actuación.

Existe un punto específico del ADN en el que la replicación va a empezar:
Punto de Iniciación en Procariotas

 En Escherichica coli el punto de iniciación se denomina ori-c y tiene aproximadamente 245 pares de bases.

En Escheririchia coli la proteína de iniciación es la proteína dra A. La replicasa comienza a replicar en direcciones contrarios, con lo que se acabarán encontrando en un punto final.

Excepcionalmente, en algunos virus, a partir de un punto de iniciación habrá una sola horquilla de iniciación, siendo unidireccional en lugar de bidireccional.

El ADN eucariótico tiene varios puntos de iniciación de la réplica:
Puntos de inicio en eucariotas.
Estos puntos de iniciación promedian unas 50μm, pero este no es un valor exacto. La réplica es simultanea en las dos hebras y en las dos direcciones.
Replicación en varios puntos de inicio.

Esta imagen puede verse a microscopio electrónico, apreciándose las horquillas u ojales de ADN.

A cada unidad de replicación se les llama replicones. La unidad de síntesis es mucho más lenta que en las bacterias. Además, los cromosomas son más largos. Tener varias unidades de replicación es imprescindible, de lo contrario debería pasarse meses replicando. Comenzando en varios puntos se acelera mucho el proceso.

Las polimerasas, para actuar, deben tener separadas las hebras. De esto se encarga un enzima denominado helicasa, que consume aproximadamente 2 ATP por cada par de bases que separa.
Separación de las hebras de ADN
En la helicasa hay más de una proteína, se sabe que al menos son dos, una sobre cada hebra.

Si dejásemos así el ADN, este tendería a volver a enlazarse espontáneamente. Para evitar que se cierre el dúplex actúan otras proteínas denominadas proteínas enlazantes del ADN (DBP ó DSS). En realidad son cuatro subunidades. Una vez que una DBP se une, facilita que las demás también se unan, es decir, hay una unión cooperativa.

Pero aún se plantean más problemas. Al ir desenrollando el ADN, se irán formando superenrollamientos positivos más adelante. Al principio esto no plantea problemas serios, ya que en los cromosomas suele existir un superenrollamiento negativo, de forma que absorbe la tensión. Pero llegará un momento en el que ya no pueda con ello y empezarán a formarse demasiados superenrollamientos positivos. Pasa tanto en eucariotas como en procariotas.
Super-enrollamientos derivados de la separación de hebras.
En eucariotas el problema podría solventarse haciendo girar el resto del cromosoma. Pero esto crearía muchos problemas energéticos.

El problema es solucionado por las topoisomerasas, que actúan delante de cada horquilla evitando que se enrolle. Hay dos mecanismos distintos. Las de tipo I cortan una hebra, con lo cual la tensión se alivia al girar el otro trozo, enlazándose de nuevo donde cortamos (en lugar de girar todo el cromosoma, cortamos y hacemos girar un trozo de cromátida). El otro son las de tipo II, que actúan en Escherichia coli y que se denominan girasas. Estas van gastando energía por delante de l ahorquilla y creando superenrollamientos negativos. Tienen que romper las dos cadenas y pasar una cadena por encima de la otra para crear este superenrollamiento.

Y ahora intervendrían las ADN-polimerasas ADN-dependientes. En Escherichia coli se conocen 3, nombradas como I, II y III por orden de descubrimiento. Su actividad enzimática es actividad polimerásica, de forma que:


El enzima tiene el mismo centro activo para las cuatro bases que tiene que reconocer (es decir, dATP, dGTP, dTTP, dCTP), pero no reconocería a las dNMPs y dNDPs. Deben estar las cuatro a al vez, ya que deben ir entrando en un orden determinado y si falta una se interrumpe el proceso. Se necesita Mg2+ porque los núcleotidos (dATP, dGTP, dTTP, dCTP) se unen en un complejo que debe ser reconocido.

Todas las ADN polimerasas catalizan la síntesis de ADN en la dirección 5’3’.
Reacción de la ADN polimerasa
Posteriormente tiene lugar la reacción:


Hacen falta otras dos cosas. Por un lado habrá un patrón que vaya indicando qué núcleotidos se deben colocar. El patrón será la otra hebra de ADN, que será leída en dirección 3’5’.

Por otro lado, la ADN polimerasa necesita un cebador o hebra cebadora. Es decir, no puede empezar de cero, debe tener un cebador antiparalelo, perfectamente emparejado.

El cebador puede ser de ADN o de ARN. En la replicación en vivo la síntesis comienza con unas hebras cebadoras de ARN. Una vez se ha empezado, el propio ADN tiene el extremo 3’ por el que se puede guiar.
Hebras cebadoras
Hay otras dos actividades, las exonucleásicas, que consisten en hidrolizar núcleotidos a partir de uno de los extremos de uno de los polinucleótidos.


Esta reacción es válida empezando por el extremo 3’ o por el 5’. Da lugar a dos tipos, la exonucleasa 5’3’ y la exonucleasa 3’5’.

La actividad exonucleásica 3’5’ es correctora, va revisando lo que acaba de polimerizar, corrigiéndola si hay errores. Si encuentra un error, se hidroliza el nucleótido y lo repite. Como vemos, va en sentido contrario de la síntesis.
Actividad correctora: exonucleasa 3' 5'

El factor de error de la polimerasa es de entre 10-4 y 10-5 sin la actividad correctora. Gracias a la actividad correctora este error disminuye al menos a 10-7 e incluso menos (10-9 ó 10-10).

La exonucleasa 5’3’ tiene su punto de acción por delante de la polimerasa. Va limpiando el camino, hidroliza bases que sobrasen.

La ADN-polimerasa I es la más abundante en Escherichia coli. Existen alrededor de 400 copias por célula. Su velocidad es de unos 600 nucleótidos por minuto.
La ADN-polimerasa III es un complejo grande, de al menos trece subunidades y con muchas funciones. Son menos abundantes, alrededor de 20 por célula, pero actúan muy rápido, unos 10000 nucleótidos por minuto. En vivo podría actuar incluso más deprisa. Posee una replicasa denominada haloenzima-polimersa III.

De la ADN-polimerasa II no se conoce bien su función. Es mucho más lenta, entre 20 y 30 nucleótidos por minuto y no tiene actividad exonucleásica 5’3’. Pero si tiene actividad correctora, es decir, actividad exonucleásica 3’5’.

Las células eucarióticas tienen ADN polimerasas que actúan igual, tanto en sentido, como en la necesidad de patrón y de cebador. Las funciones exonucleásicas pueden aparecer o no dependiendo de la polimerasa.

Hay tres tipos, α, β y γ. La α viene a ser, aproximadamente, la polimerasa III de Escherichia coli. Es la que replica la mayor parte del ADN. La β colabora y repara. La γ aparece en las mitocondrias y se encarga de duplicar el ADN mitocondrial.

La réplica de una hebra y otra es simultanea, pero no va a ser igual. Una va a ser continua y la otra discontinua, ya que las dos hebras molde son antiparalelas y si en una de ellas el avance va en sentido 5’3’, en la otra irá en dirección 3’5’. Pero las polimerasas conocidas solo incorporan nucleótidos en la dirección 5’3’. El hecho de que la réplica en la otra dirección no tiene lugar fue comprobado por Okazaki. La réplica tendrá lugar en la misma dirección en las dos hebras, lo que ocurre es que se van haciendo tramos en la dirección 5’3’.

Habrá por lo tanto una hebra retardada o seguidora, en la que la síntesis será discontinua, fragmentada. La incorporación se va haciendo en pequeños fragmentos en dirección 5’3’ que después, sucesivamente, se unen. Se les denomina fragmentos de Okazaki. A la hebra que avanza de forma continua se le denomina hebra guía o conductora en síntesis continua.

Si lo vemos a partir de un punto de iniciación, hacia un lado veremos una hebra continua y otra discontinua:

Las ADN polimerasas, tanto para fabricar la hebra continua como los fragmentos de ozkazaki, requieren cebadores para empezar. El cebador va a ser de ARN, aunque después va a ser sustituido. Se trata de un proceso progresivo, se van poniendo y quitando cebadores.

El ARN cebador es fabricado por la primasas, una ARN-polimerasa ADN dependiente. Sintetiza ARN a partir de ADN, como siempre en dirección 5’3’.

(NTP)n + NTP  (NTP)n+1 + PPi

La primasa no necesita cebador y carece de capacidad correctora, no tiene actividad exonucleásica 3’5’. El nivel de errores será mucho mayor, pero carece de importancia porque después los cebadores se quitan.

La primasa forma parte del primosoma, un complejo en el cual hay al menos seis proteínas adicionales más. El primosoma forma, a su vez, parte del replisoma antes citado. Las otras proteínas del primosoma tienen distintas funciones, como hidrolizar ATP para conseguir energía (sin este consumo de ATP, la síntesis no funciona).

Primer actúa la primasa, fabricando el cebador en el punto de iniciación. La ADN-plimerasa III utiliza como inicio el hidroxilo 3’ del ARN cebador. Y comenzará a sintetizar, terminando cuando se encuentre con algo que la pare, como el inicio de otro replicón (1).

Posteriormente la primasa fabricará otro cebador, situándolo a una distancia igual al número de nucleótidos que posea el fragmento de Okazaki, es decir, lo sitúa a una distancia igual al tamaño de un fragmento (2).

La ADN-polimersa III sintetiza el primer fragmento de Okazaki a partir de este cebador, rellenando el hueco que queda entre los dos cebadores. Se detiene cuando encuentra el cebador de inicio, es decir, el primer cebador. Cuando la ADN-polimersa III encuentra el obstáculo se encuentra por delante, por lo cual su actividad exonucleásica no puede actuar, no puede eliminar el ARN cebador con el que se encuentra. Y quedará, además, un nucleótido por poner. En el extremo 5’ del cebador hay un grupo trifosfato sobre el que no puede actuar la ligasa, quedando una brecha (3).

Ahora actuará la ADN-polimersa I. Con su actividad exonucleásica 5’3’ hidrolizará los nucleótidos del ARN cebador. Y actuará también como polimerasa 5’3’. La ADN-polimerasa I usará como cebador el extremo 3’ terminal que ha dejado la ADN-polimersa III al fabricar el fragmento de Okazaki. Es decir, usará como cebador ADN en lugar de ARN. Y rellena el fragmento, qudando en la zona trozos de ARN del cebador destrozados por la ADN-polimersa I (4).

Ahora ya puede actuar la ADN-ligasa. Une el fosfato 3’ terminal de un extremo fosfato con el 5’ del otro lado. Ahora ya puede actuar, porque al actuar la ADN-polimersa I ya no hay grupo trifosfato (5).

Como vemos, el tamaño de un fragmento de Okazaki es lo que hidroliza la ADN-polimerasa III y lo que sintetiza la ADN-polimerasa I. Todos los cebadores son iguales..

A partir de esto, se repite y a una distancia igual al tamaño de un fragmento de Okazaki vuelve a colocarse otro cebador.

El esquema es el siguiente:


Podemos ver un pequeño esquema de lo que ocurre con un ADN circular de una bacteria:

El último cebador actúa como molde para la ADN polimerasa I, hidrolizando posteriormente este cebador y actuando la ligasa. Esto ocurrirá en las dos copias.

En eucariotas ocurriría algo parecido, pero con los replicones que se van encontrando:

Replicasa y replisoma deben tener una orientación espacial concreta. En el replisoma primero irá la helicasa y los enzimas auxiliares (BDP). Después irá la primasa, encargada de hacer el primer cebador. Solo se necesita una, ya que primero hace el cebador de una y después se dedica a sintetizar todos los cebadores posteriores. Y detrás, las dos ADN polimerasas III, una a cada lado. No son exactamente iguales, ya que una se encarga de sintetizar la hebra adelantada y la otra a la seguidora. Aunque no son exactamente iguales, son parecidas. La hebra molde debe hacer un bucle sobre la ADN polimersa III para conseguir que el cebador se fabrique en la dirección correcta. La molde hace ese rizo o bucle, posteriormente se deshace cuando se ha sintetizado el fragmento, avanza un poco y se vuelve a enrollar.

La ADN polimerasa III de la seguidora va un poco más atrás debido al bucle que se va formando, que hace el doblez. De hecho, comenzó un poco antes.
Pero ¿qué ocurre con las proteínas histónicas en los eucariotas? Tienen que sintetizar nuevas histonas, deben formarse otras tantas como las que había, las antiguas no se degradan, se aprovechan. Por métodos radiactivos se ha demostrado que los octámeros antiguos y los nuevos van separados, no se intercambian las nuevas con las antiguas. Las histonas nuevas van solo al ADN replicado y solo a uno de los dos dúplex hijos, uno se lleva los octámeros viejos y el otro todos los antiguos (a partir del punto de inicio).

Parece que cuando el ADN se está replicando, los octámeros paternos antiguos son aprovechados por la hebra continua. Las nuevas son asociados al dúplex de la hebra retardada.

domingo, 3 de junio de 2012

Fecundación animal.


Fecundación y gametos.

Los gametos tienen poco tiempo de vida, solo unas horas. El espermatozoide debe llegar al óvulo lo más rápido que pueda y cederle los n cromosomas de su núcleo. Además, aportará al cigoto un centriolo (es decir, los centriolos proceden del padre). El espermatozoide hace que el óvulo en parada metabólica inicie su desarrollo.

Veremos como ejemplo de fecundación el caso del erizo de mar. El macho vierte los espermatozoides en el agua de mar. Deben alcanzar al óvulo. Además, el espermatozoide no debe fecundar a otro tipo de célula. Es decir, necesitamos que sea específico.

El encuentro tiene lugar al azar, pero el movimiento de los espermatozoides siempre termina por encontrar algún óvulo. En algunas especies tiene  lugar una atracción química.

Primer reconocimiento específico.

El primer reconocimiento específico tiene lugar cuando el espermatozoide entra en contacto con la ganga. Hay una reacción de interacción entre las glucoproteínas de la ganga y las de la membrana en la zona del acrosoma. No es una interacción totalmente específica. Puede ocurrir que existan reconocimientos incluso de otras especies de erizo de mar.
Primer reconocimiento específico
Se va a producir la activación o capacitación del espermatozoide, ara que pueda entrar dentro del óvulo. Es desencadenado por el reconocimiento. Y se produce lo que se denomina reacción acrosomal.

Reacción acrosomal.

Tiene dos componentes la exocitosis del acrosoma y la formación del tubo acrosómico.

En la exocitosis del acrosoma se produce una reacción en la membrana del espermatozoide, permitiendo la entrada de iones de calcio por unos canales abiertos por ligando. El calcio induce, por un lado, la fusión de las membranas del acrosoma y del óvulo. Como consecuencia de esta fusión de membranas, se libera el contenido del acrosoma.
Liberación del material del acrosoma
Entre las sustancias liberadas del acrosoma están las lisinas espermáticas, que hidrolizan la ganga.

Al mismo tiempo, el calcio activará en la membrana una bomba de intercambio que introduce sodio (Na+) en la célula y expulsa protones (H+), es decir, transporte antiporte. El sodio entra por gradiente de concentración, ya que hay mucho sodio en el agua de mar (recordamos que hablamos de la fecundación en erizos de mar). La expulsión de protones hace que el pH del interior suba. Al subir el pH se produce la polimerización de filamentos de actina, que hace que se forme un tubo denominado tubo acrosómico. En la membrana que recubre el tubo acrosómio hay una proteína, que inicialmente miraba hacia adentro del acrosoma y ahora mira hacia fuera y se denomina bindina.

Formación del tubo acrosómico
En resumen:
Resumen de la fase temprana en la fecundación.
El tubo acrosómico aumenta de tamaño y avanza ayudado por la lisina. Toca la membrana del óvulo. Entonces se producen un reconocimiento específico entre la bindina y unos componentes receptores de la membrana del óvulo. Estamos en la fase de reconocimeinto específico.

Reconocimiento específico.

Hasta aquí podrían haber llegado varios espermatozoides a la vez a un mismo óvulo. Pero a partir de aquí, a partir del reconocimiento específico, solo puede avanzar uno.

El sistema que veremos es parecido al que tiene lugar en mamíferos, aunque no es exactamente igual. Debemos tener en cuenta que en los óvulos de mamíferos no hay ganga, hay otra serie de líquidos diferentes. Habría exocitosis acrosomal, pero no se formaría tubo acrosómico y la fusión, en lugar de ser por un tubo acrosómico (que no tiene) se lleva a cabo lateralmente, directamente con la membrana del espermatozoide. Pero también habrá, lógicamente, un reconocimiento específico.

Como decíamos, en el erizo de mar el tubo llega a la membrana del óvulo y la bindina se une a los receptores.
Reconocimiento específico del proteínas de bindina
Tras el reconocimiento, tendrá lugar la fusión de membranas.

Fusión de membranas.

Se unen la membrana del espermatozoide con el plasmolema.
Fusión de membranas
El óvulo, tras esto, forma un pequeño abultamiento en forma de verruga en esta zona, que se denomina cono de fecundación. Y comenzará a penetrar en el interior, es decir, habremos llegado a la fase de penetración.

Penetración.
El cono de penetración empuja al espermatozoide hacia adentro. Pero el espermatozoide no entra al completo, lo que queda dentro es el núcleo y el centriolo, mientras que el flagelo permanece en el exterior. El cono de penetración está formado por una especie de microvellosidades.
Penetración del núcleo del espermatozoide en el óvulo
Solo un espermatozoide puede entrar dentro del núcleo (monoesperma), solo se puede fusionar la membrana de un espermatozoide. Puede llegar más de un espermatozoide a la fase de reconocimiento, pero no entrará más que un espermatozoide. En caso contrario, se formaría poliespermia, con lo cual el resultado sería una célula 3n. Lo normal sería que esta célula no sería viable, moriría. No obstante, debe haber un sistema que evite la poliespermia. Y para ello, el óvulo debe ser activado.

Activación del óvulo.

El óvulo se encontraba parado metabolicamente. Y el espermatozoide lo saca de este estado. Desencadena el programa de desarrollo del óvulo, que se encuentra impreso en el propio óvulo. Experimentalmente, se puede lograr que el óvulo se desarrolle sin ser fecundado, por ejemplo pinchando con una aguja la membrana. Al desarrollo natural de los óvulos sin ser fecundados se denomina partenogénesis y en algunas especies es un mecanismo normal (en ocasiones, hay gametos que son 2n).

La activación del óvulo comienza tras el reconocimiento específico. Este sería un punto sin retorno. Y encontraremos dos grandes tipos de respuestas al reconocimiento, las respuestas tempranas, que suceden en el primer minuto tras el reconocimiento, y las respuestas tardías, que suceden después del primer minuto.

La primera respuesta temprana es un cambio en la concentración de sodio. En menos de un segundo se producen la apertura en la membrana del óvulo de un canal de Na+. Dado que es un ión abundante en el agua de mar, está mucho más concentrado que en el interior del óvulo, con lo que se produce la penetración del mismo.
Intercambio iónico en la fusión de membranas
La membrana del óvulo posee, originalmente, un potencial transmembrana negativo. Tras la apertura de los canales de sodio, este entra en el interior a favor de gradiente y provoca un cambio en el potencial transmembrana, llegándose a valores de 20mV. Es decir, la membrana sufre una fuerte despolarización. Si la membrana no está polarizada, no se puede fijar ningún espermatozoide más, debido probablemente a algún cambio en la membrana. Y si había algún otro espermatozoide enganchado (pero sin fusionar su membrana) ahora ya no podrá entrar, ya no podrá fusionar su membrana.

Lo más probable es que en cuanto se fusione uno, ya no se puedan fusionar más. Pero hay un cierto porcentaje de errores en los que penetran más espermatozoides de la cuenta. Si antes de que se fusione el primer espermatozoide se producen una despolarización artificialmente, ningún espermatozoide podrá entrar.

En unos minutos, la membrana volverá a su estado normal, así que debe establecerse otro bloqueo para que ningún espermatozoide entre más tarde. Y si denominamos al anterior primer bloqueo, ahora comenzaremos a hablar de segundo bloqueo de la poliespermia.

Se formará la membrana de fecundación. Sucede entre veinte y treinta segundos más tarde. Hay un aumento del calcio (Ca2+) dentro del citoplasma. Procede del propio óvulo. Se encuentra dentro de los gránulos corticales. Los gránulos corticales liberan calcio al interior de la célula y este aumento de calcio induce a los gránulos a fusionarse con la membrana del óvulo y verter su contenido al exterior por exocitosis. Al liberar calcio y fusionarse con la membrana, los granos inducen a los granos vecinos a llevar a cabo el mismo proceso, es decir, a liberar calcio al interior y liberar su contenido al exterior por exocitosis. Y esto induce también la liberación en los vecino. Y de este modo la señal se va propagando por todo el óvulo.
Liberación de los gránulos corticales
 El óvulo pasa de amarillo a blanco. Debemos tener en cuenta que el óvulo tiene, aproximadamente, 15000 gránulos corticales.

Entre los componentes que se liberan al exterior hay proteínas y glucopolisacáridos. Un enzima va cortando las uniones de la capa vitelina con el plasmolema, con lo que ambas se van separando. Y otro enzima destruye la glicoproteína de los receptores de bindina.

Los glucopolisacáridos hacen que entre agua, por procesos osmóticos, a este espacio que se genera entre la membrana vitelina y el plasmolema. Se va generando un espacio perivitelino. Una serie de proteína estructurales se incorporarán a la membrana vitelina. Esto provoca que se haga más gruesa, pasando a denominarse membrana de fecundación. La membrana de fecundación establece el segundo bloqueo.
Otra serie de glucopolisacáridos se quedarán unidos al plasmolema, generando la capa hialina. Esto ayuda a que durante las primeras divisiones las células queden pegadas unas a otras.
Membranas y formación de capa hialina
Un segundo efecto del aumento de Ca2+ es que provoca la activación del enzima NAD-Quinasa. Se encarga de transformar NAD en NADP. El óvulo va a necesitar sintetizar muchas cosas y el NADP es una molécula imprescindible para la biosíntesis.

El Ca2+ también activa una bomba de transporte que intercambia Na+ por H+. Este cambio desencadena las respuestas tardías. El cambio de pH es el que induce estas respuestas. Se forman proteínas, se activan sistemas de transporte, se divide el ADN. Entre 8 y 10 minutos después de la subida de pH en el interior, arrancan todos los procesos. Y una vez han arrancado, seguirán adelante y no se detendrán aunque el pH baje.
Intercambios de calcio, sodio y cambios de pH en la fecundación.

En resumen:
Resumen de la fase tardía de la fecundación.

Cariogamia.

Si es una especie en la que el óvulo no ha terminado su maduración, esta debe completarse ahora, debe finalizar el proceso de meiosis. Cuando se completa, el proceso sigue.

El proceso pasa por varias fases. La primera fase es la monoáster, en la cual el núcleo masculino gira 180º, colocándose al revés, con el centriolo proximal hacia delante. Este se dividirá y comenzará a formarse el diplosoma. El núcleo masculino comienza a rehidratarse e hincharse, aumentando de tamaño y a descondensar la cromatina.

Posteriormente pasamos a la fase diaster. Los núcleos se van acercando y los diplosomas se han dividido y comienzan a separarse.

En la anfimixis o cariogamia propiamente dicha los núcleos se fusionan.